濁度法測(cè)定12-去羥基阿奇霉素的效價(jià)

來(lái)源：http://www.xfzhuw.com/ 作者：余氯檢測(cè)儀 時(shí)間：2019-01-04

　　【摘要】 目的 建立濁度法測(cè)定12.去羥基阿奇霉素效價(jià)的方法。方法 以肺炎克雷伯菌為試驗(yàn)菌，加菌量0.6%~1.0%(V/V)，37℃±0.5℃培養(yǎng)4 h左右測(cè)定。結(jié)果 抗生素線性濃度為2.0~10.0 U/ml，二劑量法原料的平均回收率為101.2%，RSD為2.2%(n=9)。結(jié)論 本方法靈敏，快速，影響因素較少，可作為測(cè)定12.去羥基阿奇霉素的效價(jià)的方法。

　　【關(guān)鍵詞】 效價(jià);濁度法;12.去羥基阿奇霉素

　　12-去羥基阿奇霉素是由紅霉素C為原料，通過(guò)化學(xué)合成的方法合成的。本藥物屬?gòu)V譜抗菌藥， 對(duì)大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌以及細(xì)胞內(nèi)病原菌、支原體和衣原體等有較好的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌也有一定的抗菌活性。其抗菌活性較阿奇霉素為強(qiáng)。

　　本藥物屬于新藥，目前尚無(wú)含量測(cè)定方法。本文建立了濁度法測(cè)定12.去羥基阿奇霉素效價(jià)的方法。通過(guò)對(duì)12.去羥基阿奇霉素用比濁法測(cè)定其效價(jià)的研究，即可直觀反應(yīng)藥物的抗菌活力，又可在檢測(cè)當(dāng)天獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　1 儀器與試劑

　　CBZ.1抗生素光度比濁法測(cè)量?jī)x、石英培養(yǎng)杯(厚度1 cm)，北京潮聲公司。

　　肺炎克雷伯菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 103]，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

　　阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：130352.200405含量：936 U/mg)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。12.去羥基阿奇霉素(河北省藥品檢驗(yàn)所自主合成)。

　　抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(hào)(pH7.8，批號(hào)060403)由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供(中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制);滅菌0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)均按中國(guó)藥典2005年版二部附錄配制。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 一劑量法

　　2.1.1 菌液的配制 取肺炎克雷伯菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在35℃~37℃培養(yǎng)18~22 h，臨用時(shí)，用0.9%滅菌氯化鈉溶液洗下;取新鮮的菌懸液適量，加12%甲醛液1 ml殺滅，加生理鹽水做適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)沟闷湓?80 nm波長(zhǎng)處的吸收值為1.0，記錄其稀釋所用的生理鹽水的毫升數(shù)和1 ml 12%甲醛液的總毫升數(shù)，再將原菌液按此比例稀釋?zhuān)礊樵囼?yàn)菌液。取試驗(yàn)菌液0.6~1.0 ml加至培養(yǎng)基100 ml中，搖勻，為實(shí)驗(yàn)菌液。

　　2.1.2 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)品溶液取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱(chēng)取，加乙醇溶解并用水稀釋成1 000 μg/ml的溶液，作為儲(chǔ)備液備用;精密量取儲(chǔ)備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)進(jìn)一步稀釋成2、4、5、8、10 U/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

　　2.1.3 培養(yǎng)與測(cè)定 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 ml，加入滅菌培養(yǎng)管中，再加入實(shí)驗(yàn)菌液9.0 ml，置抗生素比濁法測(cè)量?jī)x內(nèi)，于37℃培養(yǎng)。另取稀釋溶劑1.0 ml，加空白培養(yǎng)基9.0 ml，混勻，作為空白對(duì)照，儀器在線于530 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定各管肺炎克雷伯菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)不同培養(yǎng)時(shí)間下的吸光度值(A)。根據(jù)量反應(yīng)平行線原理計(jì)算供試品的效價(jià)值。

　　2.2 二劑量法

　　2.2.1 溶液的配制 ①標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密量取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;②供試品溶液取12.去羥基阿奇霉素適量，加乙醇溶解并用水稀釋成1 000 μg/ml的溶液，作為儲(chǔ)備液備用;精密量取12.去羥基阿奇霉素儲(chǔ)備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的供試品溶液。

　　2.2.2 菌液的配制 同2.1.2項(xiàng)下制備方法。

　　2.2.3 培養(yǎng)與測(cè)定 同2.1.3項(xiàng)下方法。

　　2.3 線性與范圍的測(cè)定 照抗生素微生物檢定一劑量法測(cè)定，并以各組濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致菌液吸收度的值對(duì)溶液對(duì)數(shù)濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為：

　　回歸直線方程 Y=bX+a=.0.471 5 X+0.832 6相關(guān)系數(shù)r=0.995 5。

　　結(jié)果表明：采用標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行一劑量法試驗(yàn)，在2~10 U/ml的濃度范圍里，呈良好的線性關(guān)系。

　　2.4 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品及一批已知含量的12.去羥基阿奇霉素原料樣品，精密稱(chēng)定，加乙醇溶解并用水稀釋成800、1 000、1 200 U/ml的溶液，作為儲(chǔ)備液備用;精密量取儲(chǔ)備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成3.2和6.4 U/ml、4.0和8.0 U/ml、5.0和10.0 U/ml的供試品溶液。在上述條件下測(cè)定，測(cè)得回收率結(jié)果為平均加樣回收率為101.2%，RSD為2.2%(n=9)。

　　2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 用已知含量的12.去羥基阿奇霉素樣品一批，共測(cè)定6次，結(jié)果平均含量為950 U/mg，RSD為1.8%。

　　2.6 穩(wěn)定性考察 主要考察了抗生素溶液，即貯備溶液和測(cè)定溶液穩(wěn)定性對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

　　結(jié)果表明：本品的濃溶液和點(diǎn)樣用稀溶液放置冰箱保存可穩(wěn)定2 d，完全可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需要。

　　2.7 專(zhuān)屬性考察 采用回收率試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)2.4。

　　2.8 樣品測(cè)定 按上述濁度法測(cè)定法的二劑量法，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

　　3 討論

　　3.1 測(cè)定條件的選擇

　　3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌、培養(yǎng)基及加菌量的選擇 12.去羥基阿奇霉素為廣譜抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌敏感，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌也有一定的抗菌活性。曾選用金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌同時(shí)作實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對(duì)于本品種來(lái)說(shuō)更為敏感。因此，本研究選擇肺炎克雷伯菌作為實(shí)驗(yàn)菌。培養(yǎng)基采用國(guó)內(nèi)外藥典通用的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(hào)，pH為7.0，滅菌后為澄清的液體培養(yǎng)基，適合肺炎克雷伯菌生長(zhǎng)。

　　菌液濃度：比濁側(cè)定時(shí)，菌液過(guò)濃亦可使?jié)舛?吸收度不成直線關(guān)系;但菌液濃度過(guò)稀，則讀數(shù)偏低，誤差增大。一般控制吸收度讀數(shù)在0.3~0.7較為適宜。

　　3.1.2 測(cè)定時(shí)間的選擇 采用試驗(yàn)菌的不同傳代次數(shù)(3、4、5代)及不同加菌量(0.6~1.0%)，以不同抗生素濃度試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)曲線。發(fā)現(xiàn)，在4 h左右可達(dá)到所需濃度范圍(即培養(yǎng)一定時(shí)間后，吸光度應(yīng)在0.3~0.7，劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1)。

　　3.1.3 時(shí)間的一致性 主要是使每管的培養(yǎng)時(shí)間相等，實(shí)驗(yàn)時(shí)在試管中加入含試驗(yàn)菌液的培養(yǎng)基后，應(yīng)立即加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，混合均勻。必要時(shí)可先將培養(yǎng)基冷卻至2℃~4℃左右，再接種菌種，并在此溫度下，將含菌培養(yǎng)基加至各試管中，可避免加注試管先后的誤差。培養(yǎng)終止時(shí)原應(yīng)將各管同時(shí)放入冰浴中，并盡快加入甲醛溶液滅活，使各試驗(yàn)管的培養(yǎng)時(shí)間一致，現(xiàn)采用儀器在線測(cè)定，則不需此項(xiàng)操作。

　　3.2 濁度法具有快速(試驗(yàn)過(guò)程3~4 h，加上其他操作，可在當(dāng)天獲得結(jié)果)，易于操作，結(jié)果用儀器測(cè)定，便于自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn);更重要的是采用液體培養(yǎng)基，消除了多組分抗生素在固體培養(yǎng)基中擴(kuò)散不同的影響，使得試驗(yàn)的靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度都較瓊脂擴(kuò)散法好。但濁度法對(duì)試驗(yàn)儀器的性能及試驗(yàn)器具的要求較高(如：培養(yǎng)溫度要求一致，比色管的清潔等)，另外，任何影響液體培養(yǎng)基內(nèi)微生物生長(zhǎng)的因素都會(huì)影響抗生素效價(jià)的測(cè)定，這是其缺點(diǎn)。因此，隨著大量單組分抗生素采用HPLC法測(cè)定含量，濁度法將成為不易采用HPLC法的抗生素和多組分抗生素效價(jià)測(cè)定的主流。12.去羥基阿奇霉素。

　　參考文獻(xiàn)

　　1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2005年版二部).化學(xué)工業(yè)出版社，2005:82.

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